细胞冻存是一种将细胞置于低温环境中的技术，目的是降低细胞代谢，从而实现细胞的长期存储，以备后续实验或临床应用。通常采用慢冻原理进行细胞冻存，这种方式能够使细胞逐步脱水，避免因冰晶生成过大而对细胞造成损害。

一、原理

当温度降至-70℃时，细胞内几乎所有代谢活动及酶活性将停止，低于-130℃时，细胞能够达到最佳的存活率。使用液氮可以有效地实现细胞的长期保存。冻存保护剂二甲基亚砜（DMSO）能迅速穿透细胞膜，降低冰点并延缓冷冻过程，同时增加细胞膜的通透性，提高细胞内离子浓度，降低冰晶的形成，从而有效保护细胞。

二、贴壁细胞冻存操作步骤

1. 预热冻存液；
2. 使用PBS冲洗细胞，加入胰酶进行消化（该步骤与细胞传代相同）；
3. 消化结束后，重悬细胞并转移至无菌EP管，1000rpm离心5分钟；
4. 弃上清，加入预热的细胞冻存液，细胞冻存最佳密度为5×10^6~1×10^7/ml，一般不低于5×10^5/ml；
5. 分装后，拧紧冻存管盖并标记；
6. 将分装好的冻存管转入程序降温盒，放入-80℃冰箱过夜；
7. 将冻存管转移至液氮进行长期保存。

三、悬浮细胞冻存操作步骤

1. 使用移液管将细胞悬液均匀吹吸，移入离心管；
2. 以1000rpm离心3分钟，收集细胞沉淀；
3. 用预热的冻存液重悬细胞，最佳冻存密度为3-5×10^6/ml，一般不低于5×10^5/ml；
4. 分装后，拧紧冻存管盖并做好标记；
5. 将分装好的冻存管转入程序降温盒，放入-80℃冰箱过夜；
6. 将冻存管转移至液氮进行长期保存。

注意事项

① 细胞培养、传代及冻存过程中需严格执行无菌操作；
② 传代时要适度消化，消化时间会受到消化液种类、配制时间及加入培养瓶量等多种因素影响，需注意观察细胞形态变化，若出现胞质回缩或连接松散现象，需立即终止消化；
③ 传代应在细胞处于对数期且未达到汇合状态时进行；
④ 冻存液要提前配制，切勿直接将DMSO加入细胞悬液；
⑤ 应选择汇合度在80%-90%且活力超过90%的细胞进行冻存，以保证最佳状态，冻存密度也可根据细胞特性进行调整；
⑥ 程序冻存盒、细胞冻存液及完全培养基等试剂需预先复温至室温；
⑦ 冻存前应避免消化时间过长、吹打力度过重及离心转速过大等，以免造成细胞损伤；
⑧ 冻存管盖子必须拧紧，以防复苏时水分渗入造成污染；
⑨ 不可将细胞长时间存放于-80℃冰箱，建议存放时间不超过3天；
⑩ 在运输细胞至细胞房时，要确保细胞放在干冰或冰盒中。

选择尊龙凯时的细胞冻存解决方案，确保您的细胞存储安全可靠，不论是用于科研还是临床应用，均能为您的研究保驾护航。