中文

English

尊龙凯时贴壁细胞与悬浮细胞冻存步骤指南

发布时间:2025-02-19   信息来源:狄福姣

细胞冻存是一种将细胞置于低温环境中的技术,目的是降低细胞代谢,从而实现细胞的长期存储,以备后续实验或临床应用。通常采用慢冻原理进行细胞冻存,这种方式能够使细胞逐步脱水,避免因冰晶生成过大而对细胞造成损害。

尊龙凯时贴壁细胞与悬浮细胞冻存步骤指南

一、原理

当温度降至-70℃时,细胞内几乎所有代谢活动及酶活性将停止,低于-130℃时,细胞能够达到最佳的存活率。使用液氮可以有效地实现细胞的长期保存。冻存保护剂二甲基亚砜(DMSO)能迅速穿透细胞膜,降低冰点并延缓冷冻过程,同时增加细胞膜的通透性,提高细胞内离子浓度,降低冰晶的形成,从而有效保护细胞。

二、贴壁细胞冻存操作步骤

1. 预热冻存液;
2. 使用PBS冲洗细胞,加入胰酶进行消化(该步骤与细胞传代相同);
3. 消化结束后,重悬细胞并转移至无菌EP管,1000rpm离心5分钟;
4. 弃上清,加入预热的细胞冻存液,细胞冻存最佳密度为5×10^6~1×10^7/ml,一般不低于5×10^5/ml;
5. 分装后,拧紧冻存管盖并标记;
6. 将分装好的冻存管转入程序降温盒,放入-80℃冰箱过夜;
7. 将冻存管转移至液氮进行长期保存。

三、悬浮细胞冻存操作步骤

1. 使用移液管将细胞悬液均匀吹吸,移入离心管;
2. 以1000rpm离心3分钟,收集细胞沉淀;
3. 用预热的冻存液重悬细胞,最佳冻存密度为3-5×10^6/ml,一般不低于5×10^5/ml;
4. 分装后,拧紧冻存管盖并做好标记;
5. 将分装好的冻存管转入程序降温盒,放入-80℃冰箱过夜;
6. 将冻存管转移至液氮进行长期保存。

注意事项

① 细胞培养、传代及冻存过程中需严格执行无菌操作;
② 传代时要适度消化,消化时间会受到消化液种类、配制时间及加入培养瓶量等多种因素影响,需注意观察细胞形态变化,若出现胞质回缩或连接松散现象,需立即终止消化;
③ 传代应在细胞处于对数期且未达到汇合状态时进行;
④ 冻存液要提前配制,切勿直接将DMSO加入细胞悬液;
⑤ 应选择汇合度在80%-90%且活力超过90%的细胞进行冻存,以保证最佳状态,冻存密度也可根据细胞特性进行调整;
⑥ 程序冻存盒、细胞冻存液及完全培养基等试剂需预先复温至室温;
⑦ 冻存前应避免消化时间过长、吹打力度过重及离心转速过大等,以免造成细胞损伤;
⑧ 冻存管盖子必须拧紧,以防复苏时水分渗入造成污染;
⑨ 不可将细胞长时间存放于-80℃冰箱,建议存放时间不超过3天;
⑩ 在运输细胞至细胞房时,要确保细胞放在干冰或冰盒中。

选择尊龙凯时的细胞冻存解决方案,确保您的细胞存储安全可靠,不论是用于科研还是临床应用,均能为您的研究保驾护航。