细胞凋亡过程往往伴随着显著的细胞形态变化。例如，在细胞凋亡的早期阶段，质膜内侧的磷脂酰丝氨酸(PS)会翻转到细胞膜外表面；而在凋亡的后期，由于细胞膜通透性的增加，一些较大分子化合物（如碘化丙啶(PI)）能够自由扩散进入细胞，从而使细胞核染上红色荧光。

Annexin V/PI 检测法原理

Annexin V 是一种钙依赖性磷脂结合蛋白，能够与磷脂酰丝氨酸（PS）高亲和力地结合。由于其无法穿透完整的细胞膜，早期凋亡细胞的细胞膜在此时是完好的，对PI具备拒染性。然而，在凋亡的中晚期及死亡细胞中，PI可透过细胞膜，从而使细胞核被染成红色。因此，结合使用Annexin V 和PI，可以有效地区分早期凋亡细胞与其他细胞。

Annexin V/PI 凋亡检测推荐

品牌：尊龙凯时
名称：流式细胞凋亡检测试剂盒
货号：AC12L033
规格：100T

操作步骤

对照管的设置

1. 空白管：不加染料的诱导凋亡细胞，用于调节电压；
2. 单染管：分别加PI和荧光标记的Annexin V的单染管，用于调节补偿；
3. 实验管：诱导凋亡细胞加入所有荧光染料；
4. 阴性管：正常培养细胞加染料确认细胞状态以排除假阳性。

悬浮细胞收集染色

1. 完成细胞凋亡刺激后，离心5分钟，弃上清并收集细胞，轻轻用PBS重悬并计数；
2. 取1~5×10⁵的重悬细胞，离心5分钟，弃上清，加入500µl结合液轻轻重悬；
3. 加入5µl Annexin V-FITC，轻轻混匀，再加入5μL碘化丙啶，轻轻混匀；
4. 室温避光孵育10分钟，可以使用铝箔避光；
5. 随后进行流式细胞仪检测，Annexin V-FITC呈绿色荧光，PI呈红色荧光。

贴壁细胞收集染色

1. 将细胞培养液吸出至适当的离心管内，PBS 洗涤贴壁细胞一次，使用胰酶消化细胞；
2. 消化后同样按照悬浮细胞的操作步骤进行。

上机检测

染色孵育完成后，立即进行流式细胞仪检测或荧光显微镜检测。

检测结果提示

在流式细胞仪检测结果中，左上象限为Annexin V-/PI+表示细胞碎片或死亡细胞；左下象限为Annexin V-/PI-表示正常活细胞；右上象限为Annexin V+/PI+表示晚期凋亡或坏死细胞；右下象限为Annexin V+/PI-表示早期凋亡细胞。

注意事项

• 检测贴壁细胞时，建议使用Accutase细胞消化液以减少细胞损伤；
• 选择Annexin V的荧光染料时请考虑细胞自发荧光，以免干扰实验结果；
• 完成细胞染色后应尽快检测，不要固定细胞，可以将检测管放在冰上以减少外界影响；
• 在统计凋亡比例时，建议主要关注前凋亡细胞，因为其具有更大的生物学意义。

通过上述方法和注意事项，研究者可以在使用尊龙凯时的流式细胞凋亡检测试剂盒时，实现准确的细胞凋亡检测，帮助推进生物医学领域的研究。