细胞凋亡过程往往伴随着显著的细胞形态变化。例如,在细胞凋亡的早期阶段,质膜内侧的磷脂酰丝氨酸(PS)会翻转到细胞膜外表面;而在凋亡的后期,由于细胞膜通透性的增加,一些较大分子化合物(如碘化丙啶(PI))能够自由扩散进入细胞,从而使细胞核染上红色荧光。
Annexin V/PI 检测法原理
Annexin V 是一种钙依赖性磷脂结合蛋白,能够与磷脂酰丝氨酸(PS)高亲和力地结合。由于其无法穿透完整的细胞膜,早期凋亡细胞的细胞膜在此时是完好的,对PI具备拒染性。然而,在凋亡的中晚期及死亡细胞中,PI可透过细胞膜,从而使细胞核被染成红色。因此,结合使用Annexin V 和PI,可以有效地区分早期凋亡细胞与其他细胞。
Annexin V/PI 凋亡检测推荐
品牌:尊龙凯时
名称:流式细胞凋亡检测试剂盒
货号:AC12L033
规格:100T
操作步骤
对照管的设置
1. 空白管:不加染料的诱导凋亡细胞,用于调节电压;
2. 单染管:分别加PI和荧光标记的Annexin V的单染管,用于调节补偿;
3. 实验管:诱导凋亡细胞加入所有荧光染料;
4. 阴性管:正常培养细胞加染料确认细胞状态以排除假阳性。
悬浮细胞收集染色
1. 完成细胞凋亡刺激后,离心5分钟,弃上清并收集细胞,轻轻用PBS重悬并计数;
2. 取1~5×105的重悬细胞,离心5分钟,弃上清,加入500µl结合液轻轻重悬;
3. 加入5µl Annexin V-FITC,轻轻混匀,再加入5μL碘化丙啶,轻轻混匀;
4. 室温避光孵育10分钟,可以使用铝箔避光;
5. 随后进行流式细胞仪检测,Annexin V-FITC呈绿色荧光,PI呈红色荧光。
贴壁细胞收集染色
1. 将细胞培养液吸出至适当的离心管内,PBS 洗涤贴壁细胞一次,使用胰酶消化细胞;
2. 消化后同样按照悬浮细胞的操作步骤进行。
上机检测
染色孵育完成后,立即进行流式细胞仪检测或荧光显微镜检测。
检测结果提示
在流式细胞仪检测结果中,左上象限为Annexin V-/PI+表示细胞碎片或死亡细胞;左下象限为Annexin V-/PI-表示正常活细胞;右上象限为Annexin V+/PI+表示晚期凋亡或坏死细胞;右下象限为Annexin V+/PI-表示早期凋亡细胞。
注意事项
• 检测贴壁细胞时,建议使用Accutase细胞消化液以减少细胞损伤;
• 选择Annexin V的荧光染料时请考虑细胞自发荧光,以免干扰实验结果;
• 完成细胞染色后应尽快检测,不要固定细胞,可以将检测管放在冰上以减少外界影响;
• 在统计凋亡比例时,建议主要关注前凋亡细胞,因为其具有更大的生物学意义。
通过上述方法和注意事项,研究者可以在使用尊龙凯时的流式细胞凋亡检测试剂盒时,实现准确的细胞凋亡检测,帮助推进生物医学领域的研究。